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電泳(電泳設備)分析常用方法

添加時間:2016-10-5 13:57:00

(一)醋酸纖維素薄膜電泳設備
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。由該物質製成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小,幾乎能完全消除紙電泳中出現的“拖尾”現象,又因為膜的親水性比較小,它所容納的緩衝液也少,電泳時電流的大部分由樣品傳導,所以分離速度快,電泳時間短,樣品用量少,5μg 的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理後可使膜透明化有利於對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。
⒈材料與試劑 醋酸纖維素膜一般使用市售商品,常用的電泳緩衝液為pH8.6 的巴比妥緩衝液,濃度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要點
⑴膜的預處理:必須於電泳前將膜片浸泡於緩衝液,浸透後,取出膜片並用濾紙吸去多餘的緩衝液,不可吸得過幹。
⑵加樣:樣品用量依樣品濃度、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規電泳分析,每 cm加樣線不超過1μl,相當於60-80μg的蛋白質。
⑶電泳:可在室溫下進行。電壓為25V/cm,電流為0.4-0.6mA/cm寬。
⑷染色:一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅,糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff 試劑,脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
⑸脫色與透明:對水溶性染料最普遍應用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定,可浸入冰醋酸:無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。
(二)凝膠電泳
以澱粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質的區帶電泳法 稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用於分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠
孔徑較大,對一般蛋白質不起分子篩作用,但適用於分離同工酶及其亞型,大分子核酸等應用較廣,介紹如下:
⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂分離製備的鏈狀多糖。其結構單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束,構成大網孔型凝膠。因此該凝膠適合於免疫複合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗中常用於LDH、CK等同工酶的檢測。
⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術 在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中,DNA 分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數成反比;分子構型也對遷移率有影響,如共價閉環 DNA>直線DNA>開環雙鏈DNA。當凝膠濃度太高時,凝膠孔徑變小,環狀DNA(球形)不能進入膠中,相對遷移率為0,而同等大小的直線DNA
(剛性棒狀)可以按長軸方向前移,相對遷移率大於 0。
⑴設備與試劑:瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可製備低濃度瓊脂糖凝膠,而且製膠與加樣都比較方便,故應用比較廣泛。核酸分離一般用連續緩衝體係,常用的有 TBE(0.08mol/L Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/L EDTA)和THE(0.04mol/L Tris·HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸鈉,0.0018mol/L EDTA)。
⑵凝膠製備:用上述緩衝液配製0.5%-0.8%瓊脂糖凝膠溶液,沸水浴或微波爐加熱使之融化,冷至55℃時加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5μg/ml,然後將其注入玻璃板或有機玻璃板組裝好的模子中,厚度依樣品濃度而定。注膠時,梳齒下端距玻璃板 0.5-1.0mm,待脫凝固後,取出梳子,加入適量電極緩衝液使板膠浸沒在緩衝液下 1mm處。
⑶樣品製備與加樣:溶解於TBE或THE內的樣品應含指示染料(0.025%溴酚藍或桔黃橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用2.5%FicoⅡ增加比重,使樣品集中,每齒孔可加樣 5-10μg。
⑷電泳:一般電壓為5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行。
⑸樣品回收:電泳結束後在紫外燈下觀察樣品的分離情況,對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳後的凝膠中以不同的方法進行回收,如電泳洗脫法:在紫外燈下切取含核酸區帶的凝膠,將其裝入透析袋(內含適量新鮮電泳緩衝液),紮緊透析袋後,平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩衝液中,100V電泳2-3小時,然後正負電極交換,反向電泳2分鍾,使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含 DNA的溶液,進行酚抽提、乙醇沉澱等步驟即可完成樣品的回收。
其它還有低融點瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等,但各種方法都僅僅有利於小分子量 DNA片段(<1kb)的回收,隨著DNA分子量的增大,回收量顯著下降。
(三)等電聚焦電泳技術
等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)同軸電纜是60年代中期問世的一種利用有pH 梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由於其分辨率可達0.01pH單位,因此特別適合於分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。
⒈IEF的基本原理 在IEF的電泳中,具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極,pH值逐漸增大。如前所述,蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征,這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動,直至某一 pH位點時失去電荷而停止移動,此處介質的 pH恰好等於聚焦蛋白質分子的等電點(pl)。同理,位於酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動,直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中,等電點是蛋白質組分的特性量度,將等電點不同的蛋白質混合物加入有 pH梯度的凝膠介質中,在電場內經過一定時間後,各組分將分別聚焦在各自等電點相應的 pH位置上,形成分離的蛋白質區帶。
⒉pH梯度的組成 pH梯度的組成方式有二種,一種是人工pH梯度,由於其不穩定,重複性差,現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一係列兩性電解質的混合物,在正極端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在負極端引入堿液,如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值,即各段介質中的pH相等,用pH0表示。電泳開始後,混合物中pH最低的分子,帶負電荷最多,pI1為其等電點,向正極移動速度最快,當移動到正極附近的酸液界麵時,pH突然下降,甚至接近或稍低於PI1,這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由於兩性電解質具有一定的緩衝能力,使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點範圍。pH稍高的第二種兩性電解質,其等電點為pI2,也移向正極,由於pI2>pI1,因此定位於第一種兩性電解質之後,這樣,經過一定時間後,具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列,形成了從正極到負極等電點遞增,由低到高的線性pH梯度,如圖 16-3所示。
⒊兩性電解質載體與支持介質 理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩衝能力及電導,前者保證pH梯度的穩定,後者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導係數從而使整個體係的電導均勻。兩性電解質的分子量要小,易於應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開,而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。
常用的pH梯度支持介質有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等,其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應用。
電泳後,不可用染色劑直接染色,因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合,因此應先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質,然後再以適當的方法染色。
(四)其他電泳技術
⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法 1975年O′Farrall等人根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了 IEF/SD S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳(管柱狀)為第一向,SDS-PAGE 為第二向(平板)。在進行第一向IEF電泳時,電泳體係中應加入高濃度尿素、適量非離子型去汙劑NP-40。蛋白質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。IEF電泳結束後,將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液(內含SDS、β-巰基乙醇)中振蕩平衡,然後包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端,即可進行第二向電泳。
IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質(包括核糖體蛋白、組蛋白等)的分離是極為精細的,因此特別適合於分離細菌或細胞中複雜的蛋白質組分。 ⒉毛細管電泳 Neuhoff等人於1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質的方法,即微柱膠電泳,均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中,使凝膠充滿總體積的2/3左右,然後將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上,封閉管底,用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合後,除去水層並用毛細管加蛋白質溶液(0.1-1.0μl,濃度為1-3mg/ml)於凝膠上,毛細管的空隙用電極緩衝液注滿,切除插入粘土部分,即可電泳。
目前毛細管電泳分析儀的誕生,特別是美國生物係統公司的高效電泳色譜儀為 DNA片段、蛋白質及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術溶為一體,在從凝膠中洗脫樣品時,連續的洗脫液流載著分離好的成分,通過一個連機檢測器,將結果顯示並打印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率,生物相容性的優點,又可方便地連續洗脫樣品。
各電泳法,除另有規定外,照下述方法操作。
一、紙電泳法
1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。 常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個電泳槽 A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板 C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)D;裏格為可放濾紙 E的有機玻璃電泳槽架F,此架可從槽中取出;兩側電泳槽A內的鉑電極 D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。 電源為具有穩壓器的直流電源,常壓電泳一般在 100~500V,高壓電泳一般在500~10 000V。
2. 操作法
(1) 電泳緩衝液
枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0) 取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g 與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水 4000ml,使溶解。
(2) 濾紙
取色譜濾紙置 1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH 值不低於4,置60℃烘箱烘幹,備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙,或根據電泳室的大小裁剪,並在距長度方向一端 5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm 處做一記號備點樣用。
(3) 點樣 有濕點法和幹點法。
濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)中,濕潤後,取出,用濾紙吸幹多餘的緩衝液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩衝液中,然後用微量注射器精密點加供試品溶液,每點 10μl,共3點,並留 2個空白位置。
幹點法是將供試品溶液點於濾紙上,吹幹、再點,反複數次,直至點完規定量的供試品溶液,然後用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最後噴濕,本法適用於稀的供試品溶液。
(4) 電泳
於電泳槽中加入適量電泳緩衝液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為 18~20V/cm,電泳約1小時45分鍾,取出,立即吹幹,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
(5) 含量測定
剪下供試品斑點和與斑點位置麵積相近的空白濾紙,剪成細條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時,用3號垂熔玻璃漏鬥濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項下的規定測定吸收度,並按吸收係數計算含量。
二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 巴比妥緩衝液(pH8.6)
取巴比妥 2.76g,巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取 0.5g的氨基黑10B,溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇 45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。
(4) 透明液
取冰醋酸 25ml,加無水乙醇75ml,混勻。
3.操作法
(1) 醋酸纖維素薄膜
取醋酸纖維素薄膜,裁成 2cm×8cm的膜條,將無光澤麵向下,浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾於濾紙中,輕輕吸去多餘的緩衝液後,將膜條無光澤麵向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中。
(2) 點樣與電泳
於膜條上距負極端 2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在 10~12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4~5cm為宜。
(3) 染色
電泳完畢,將膜條取下浸於氨基黑染色液中,2~3 分鍾後,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色為止。
(4) 透明
將洗淨並完全幹後的膜條浸於透明液中 10~15分鍾,取出平鋪於潔淨的玻板上,幹後即成透明薄膜,可於分光光度計上測定和作標本長期保存。
(5) 含量測定
未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定,一般采用洗脫法或掃描法,測定各蛋白質組分的相對百分含量。 洗脫法 將洗淨的膜條用濾紙吸幹,剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶,分別浸於1.6%的氫氧化鈉溶液中,振搖數次,至洗脫完全, 於一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位,同法操作作對照。先計算吸收值總和,再計算各蛋白組分所占百分率。 掃描法 將幹燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射 (未透明薄膜) 或透射(已透明薄膜)方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖,橫坐標為膜條的長度,縱坐標為吸收度,計算各蛋白組分的百分含量。
亦可用微機處理積分計算。
三、瓊脂糖凝膠電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 醋酸-鋰鹽緩衝液(pH3.0)
取冰醋酸 50ml,加水800ml混合後,用氫氧化鋰調節pH至3.0,再加水至1000ml。
(2) 甲苯胺藍溶液取甲苯胺藍 0.1g,加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)製膠
取瓊脂糖約 0.2g,加水10ml,置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸-鋰鹽緩衝液(pH3.0)10ml,混勻,趁熱將膠液塗布於大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度約 3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。 (2) 標準品溶液及供試品溶液的製備照各藥品項下規定配製。
(3) 點樣與電泳
在電泳槽內加入醋酸-鋰鹽緩衝液(pH3.0),將凝膠板置於電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板負極端分別點樣 1μl,立即接通電源,在電壓梯度約 30V/cm,電流強度1~2mA/cm的條件下,電泳約20分鍾,關閉電源。
(4) 染色與脫色
取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液染色,用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。
四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法
1.儀器裝置
通常由穩流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極,鉑電極經隔離電線接於電泳儀穩流擋上。
2.試劑
(1)溶液 A
取三羥甲基氨基甲烷 36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml,再加水溶解並稀釋至 100ml,置棕色瓶內,在冰箱中保存。
(2)溶液 B
取丙烯酰胺 30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g,加水溶解並稀釋至100ml,濾過,置棕色瓶內,在冰箱中保存。
(3)電極緩衝液(pH8.3)
取三羥甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸28.8g,加水溶解並稀釋至1000ml,置冰箱中保存,用前稀釋 10倍。
(4)溴酚藍指示液
取溴酚藍 0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90%乙醇5ml,微熱使溶解,加 20%乙醇製成250ml。
(5)染色液
取 0.25%(W/V)考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至 10ml。
(6)稀染色液
取上述染色液 2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脫色液
(2)標準品溶液及供試品溶液的製備
照各藥品項下的規定。
(3)電泳
將已製好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內,每管加供試品或標準品溶液50~100μl,為防止擴散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚藍指示液 1滴,也可直接在上槽緩衝液中加0.04%溴酚藍指示液數滴,玻璃管的上部用電極緩衝液充滿,上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA,數分鍾後,加大電流使每管為 2~3mA,當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處,關閉電源。
(4)染色和脫色
電泳完畢,用裝有長針頭並吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入,膠條即從管內滑出,將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡 10~30分鍾,以水漂洗幹淨,再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。
(5)結果判斷將膠條置燈下觀察,根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。
相對遷移率 供試品和標準品的電泳區帶有時可用相對遷移率(R''<[m]>)進行比
較。其計算式如下: 進膠端到供試品或標準品區帶的距離 相對遷移率(R''<[m]>)=──進膠端到溴酚藍區帶的距離 掃描 將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分,由各組分的峰麵積計算百分含量。7%醋酸溶液。
3.操作法
(1)製膠
取溶液 A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混勻,抽氣趕去溶液中氣泡, 加 0.56%過硫酸銨溶液2ml,混勻製成膠液,立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達 6~7cm, 然後徐徐滴加水少量,使覆蓋膠麵,管底氣泡必須趕走,靜置約 30分鍾,待出現明顯界麵時即聚合完畢,吸去水層。
五、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分子量,是根據大多數蛋白都能與陽離子表麵活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成複合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的負電荷,消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白分子相對遷移率(R''<[m]>)的大小完全取決於分子量的高低,因此可從已知分子量的標準蛋白的對數和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量。
1.儀器裝置
除另有規定外,同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
2.試劑
(1)丙烯酰胺液溶
稱取丙烯酰胺 22.2g與雙丙烯酰胺0.6g, 溶於100ml水中,貯於褐色瓶中低溫保存。
(2) 凝膠緩衝液
稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、 磷酸氫二 鈉(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g,加水至1000ml(若有沉澱析出,可加溫至 37℃溶解)。
(3)電泳緩衝液
將凝膠緩衝液稀釋 1倍。
(4)染色液
稱取 25mg考馬斯亮藍R<[250]>,溶於57%乙醇與9.2%醋酸混合液100ml中。
(5)脫色液
取無水乙醇 75ml,加冰醋酸50ml,用水稀釋至1000ml。
3.操作法
除下列規定外,其他均同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(1)製膠
用丙烯酰胺溶液-凝膠緩衝液-水-1.6%過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺(需冷卻)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配製而成。
(2)標準蛋白溶液及供試品溶液的製備
取標準蛋白,加水製成每1ml中含2~5mg的溶液,與水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉 0.04g,溶於40ml水中)1∶3混合,置冰箱中過夜。供試品照上述方法配製。
(3)電泳 調節電流使每管為 8mA。
4.相對遷移率和分子量計算
將電泳脫色後的區帶用卡尺或用掃描定位法測量染料移動的距離、染色前膠條長度、蛋白移動距離和脫色後的膠條長度。按下式計算相對遷移率: 蛋白移動的距離 染色前的膠條長度 相對遷移率(R''<[m]>)=───×─── 脫色後的膠條長度 染料移動的前沿距離 以 R''<[m]>為橫坐標,已知分子量標準蛋白的對數為縱坐標,在半對數坐標紙上繪圖,由標準曲線中查出供試品分子量。


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