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電泳設備技術的現狀

添加時間:2016-10-5 13:57:00

早期的電泳設備技術是由瑞典Uppsala大學物理化學係Svedberg教授提出了荷電的膠體顆粒在電場中移動的現象稱其為電泳。於1937年,收ArneTiselius教授——諾貝爾獎金獲得者,利用些電泳現象,發明了最早期的界麵電泳,用於蛋白質分離的研究,開創了電滬泳技術的新紀元。此後,各種電泳技術及儀器相繼問世,先進的電泳儀和電泳技術的不斷發展,使它在生物化學實驗技術中占重要地位,按電泳的原理有三種形式的電泳分離係統:原則上按電泳的原理來分,即移動界麵電泳、區帶電泳和穩態電泳或稱置換(排代)電泳。在自由移動界麵電泳,是帶電分子的移動速率通過觀察界麵的移動來測定,該方法已成為曆史。代之以采用支持介質的區帶電泳。
  區帶電泳因所用支持體的種類、粒度大小和電泳方式等不同,其臨床應用的價值也各有差異。固體支持介質可分為兩類:一類是濾紙、醋酸纖維素薄膜、矽膠、礬土、纖維素等;另一類是澱粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。由於它們具微細的多孔網狀結構,故除能產生電泳作用外,還有分子篩效應,小分子會比大分子跑得快而使分辨率提高。它的最大優點是幾乎不吸附蛋白質,因此電泳無拖尾的現象。低濃度的瓊脂糖電泳相當於自由界麵電泳,蛋白質在電場中可自由穿透,陰力小,分離清晰,透明度高,能透過200~7000nm波長的著色區帶的檢測敏感性,為此第一類支持介質現已被第二類支持介質所替代。
  穩太電泳或稱置換電泳的特點是分子顆粒的電泳遷移在一定時間後達到穩態,如等電聚焦和等速電泳。
  區帶電泳是臨床檢驗領域中應用最廣泛的技術,有重要臨床意義,尤其是其他新技術,更擴大了其應用範圍,提高了檢測技術,現對該技術的現狀與發展作一評述。
  一、正確解釋電泳結果,有助於臨床疾病判斷的參考
  新鮮血清經電泳後可精確地描繪出患者蛋白質的全貌,一般常見的是白蛋白降低、某個球蛋白區域升高,提示不同的臨床意義。如急性炎症時,可見a1,a2區百分率升高;腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現白蛋白下降,a2球蛋白升高,β球蛋白也升高;缺鐵性貧血時可由於轉鐵蛋白的升高而呈現β區帶增高,而慢性肝病或肝硬變呈現白蛋白顯著降低,r球蛋白升高2-3倍,示免疫球蛋白多克隆增高,甚至可見β-r融合的橋連現象,還可在r區呈現細而密的寡克隆區帶;對單一克隆漿細胞異常增殖所產生的無抗體活性均一的免疫球蛋白稱M蛋白的檢測,血清蛋白電泳是其首選的實驗診斷方法。可在電泳區帶的a2-r區呈現致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生區帶,稱其為m蛋白區帶,掃描後形成高而狹窄的單株峰,若些峰在r區其峰高與峰底寬之比>2:1,而由於正常免疫球蛋白合成限製造成背景染色淺。由M蛋白所導致的一組疾病如:多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重鏈病、遊離輕鏈病、半分子病、良性單株丙球血症和雙M蛋白血症等,目前這類疾病已不屬罕見。血清蛋白電泳對這類疾病的早期診斷,療效觀察和預後判斷均有十分重要的意義。
  二、電泳技術與免疫技術相結合,大大擴大了其臨床應用的範圍
  讓電流來加速抗原與抗體的擴散並規定其運行方向、從而加快了沉澱反應速度。免疫電泳技術的種子類很多,如:對流免疫電泳(CIEP)、火箭免疫電泳(RIE)、電免疫擴散(EID)。在種免疫電泳方法牟基礎上,又不斷地派生出一些新的技術,如:免疫電泳(IEP)技術,1969年Alper與Johnson推薦免疫固定電泳(IFE)是一種包括瓊脂糖凝膠蛋白電泳和免疫沉澱兩個過程的操作,是免疫沉澱反應的一種混合技術,檢測標本可以是血清、尿、腦脊液或其他體液。1976年血清免疫固定電泳(IF)技術再次被推薦,用於M蛋白的分型。血清蛋白質在瓊脂糖凝介質上經電泳分離後,應用固定劑和各型免疫球蛋白及輕鏈抗血清,加於凝膠表麵的泳道上,經孵育讓固定劑和抗血清的在凝膠內滲透並擴散後,若有對應的原存在,則在適當位置形成抗原抗體複合物。經染色後蛋白質電泳參考泳道和抗原抗體沉澱區帶被氨基黑著色,根據電泳移動距離分離出單克隆組分,可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型。該技術的最大優勢是敏感性達50-150mg/dl,操作周期短,僅需數小時,分辨率高,結果易於分析。現最常用於M蛋白的分型與鑒定,已列入臨床實驗室的常規檢測工作。
  三、電泳技術進行同工酶譜分析,提高診斷率
  1、血清乳酸脫氫酶同工酶(iso-LDH):測定LDH同工酶有電泳法、離子交換柱層析法、免疫法、抑製劑法和酶切法,但迄今用得取多的仍是瓊脂糖凝膠電泳法。經電泳分離後要分離出五種同工酶區帶,急性必肌梗塞發病後平均6hLDH1即開始升高,LDH1/LDH2≥1為心肌損傷的陽性決定性水平,肝癌時可見LDH5明顯升高,各區帶含量的確定,將經電泳分離後的同工酶譜采用掃描予以定量,其精確度明顯高於用肉眼判斷。   2、血清肌酸激酶同工酶(ISO-CK);電子秤測定CK和CH-MB仍是目前用於證實急性心肌梗塞的道選指標。近年來國內一些單位用免疫抑製法測CK=MB,其原理為抗M亞單位的酶活性,因為正常血清中幾乎無CK=BB,故將此值乘以2可以認為大致代表CK-MB的活性。此法簡單迅速,缺點是特異性差,如患者血清中存在CK-BB或者異常CK時,都將出現假性增高。不少作者報道異常CD-同工酶,一條稱巨CK(Maxro-CK),它是CK-BB與免疫球蛋白的複合物,有IgG亦有IgA,在正常血清中Marco-CK僅占0.8%-1.6%.另一條稱線粒體CK(CK-MT),CK-MT是結合在肌肉、腦、肝內的線粒體表麵,可能是線粒體膜的碎片,在正常血清中CK-MT是不出現的,在心梗時亦不出現,隻有當組織極度損傷,由於線粒體和細胞壁極度破壞,方可在血清中檢出。由於Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗體所抑製,故當它們出現時,會導致CK-MB高於CK總活力的假性升高。使用電泳方法分離CK-MB,是根據CK-同工酶分子結構不同,在電泳緩衝液中,所帶電荷各異,可以從陰極到陽極將CK不同組份予以分離,其分別為CK-MM,CK-MB和CK-BB.電泳特點是當出現異常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等,從電泳圖譜上很容易發現,由掃描儀對各條酶進行掃描,報告各條區帶所占百分比,結合總酶活力,求得區帶的酶省略定值結果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中間,而CK-MT位置靠近陰極端,在CK-MM後麵。這樣不會將CK-BB和各種異常同工酶誤認為是CK-MB而誤診,也可解決CK-MB假性增高的錯誤原因所在。為此,CK同工酶電泳是項非常實用的檢驗技術,具有十分重要的臨床意義3、CK亞型同工酶:此外,CK-MB和CK-MM亞型測定常采用瓊脂糖凝膠等電聚焦電泳或高壓電泳,由於操作比一般電泳麻煩,故常規常測定尚無法普及。目前引進的自動電泳儀,有試劑盒提供,可作CK亞型分析,參考值:CK-MM1(57.7±4.7)%;CK-MM2為(26.5±5.3);CK-MM3為(15.8±2.5)%;CK-MM3/CK-MM1比值為0.28±0.05(範圍0.15-0.39),陽性決定性水平>0.5.AMI第一天血中以MM3為主,但第二天以後則以MM1為主。采用電泳法分離CKMB,CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2極微,一般比值近似是而非,在急性心肌梗塞後4-6hCKMB2亞型即在血循環中可被檢測到,故MB2/MB1的比例明顯升高,並早於總CK-MB片段的增高。當心肌梗塞緩解後此比便也逐漸下降。也可用於溶栓治療後的病情觀察。
  四、結合酶免疫標記抗體技術,檢測腦脊液內寡克隆區帶
  曾有作者報道采用二維電泳和銀染進行CSF蛋白質的分離與鑒定,方法繁複,耗時,現采用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離CSF中的蛋白質,並經抗原和辣根過氧化物酶標記的特異性IgG抗體進行反應來鑒定“寡克隆區帶”(OCB),經此酶免疫標記放大技術和顯色步驟,蛋白質濃度達31-125ul/L即可予以檢測,可使檢測靈敏度提高了100倍,這樣腦脊液無須濃縮,避免了在濃縮過程中蛋白質的丟失。可用於證實和分辨OCB免疫球蛋白及其型別。若在腦脊液標本中檢出OCB,而其相應標本中未能檢出區帶,則為陽性,真實地反映是由中樞神經係統本身合成的免疫球蛋白,具有重要臨床意義。它是一種定性檢測,在多發性硬化症時,OCB是一個十分重要的標誌物。但須將患者血清和CSF在同一天同步進行分析,以認證不同來源的免疫球蛋白。中樞合成免疫球蛋白是中樞神經係統疾患的一個重要信號,主要用於診斷的鑒別診斷中樞神經係統疾患如:多發性硬化症、癡呆、脊髓炎、付腫瘤性腦炎、神經性梅素等。


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